細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)研究的重要方法之一。同時(shí)，在原代細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，要任務(wù)是從組織中分離細(xì)胞。但看似簡(jiǎn)單的細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)，卻不知難倒了多少英雄好漢。下面索萊寶和大家聊聊細(xì)胞分離與培養(yǎng)那些事兒。

    如何分離細(xì)胞？  

從原代組織中分離細(xì)胞，將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。然而，為了更好地測(cè)定細(xì)胞免疫功能，我們需要從動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等。分離這類免疫細(xì)胞的方法有：密度梯度離心法、黏附分離法、流式細(xì)胞儀分離法等其他分離法。目前常用的是密度梯度離心法。索萊寶細(xì)胞分離液產(chǎn)品的研發(fā)原理就是基于不同細(xì)胞的密度差異，通過(guò)離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布。

    具體怎么實(shí)現(xiàn)呢？ 

以分離人外周血淋巴細(xì)胞為例：

1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

2. 在離心管中加入適量分離液，將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。

3. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~1000g，離心20~30min。

4. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層：上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層，離心管底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5. 小心地吸取白膜層細(xì)胞到15mL潔凈的離心管中，10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250g，離心10min。

6. 棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心10min。

7. 重復(fù)步驟6。

8. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

   細(xì)胞分離時(shí)別忘了做到這些！ 

1. 無(wú)菌操作：在樣品收集和分離過(guò)程中，應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免微生物污染。

2. 保證新鮮：血液樣本要為新鮮抗凝血（采血2 h以內(nèi)），避免冷凍和冷藏，抗凝劑優(yōu)先選擇為EDTA、枸櫞酸和肝素。

3. 分離液的保存：分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。

4. 細(xì)胞稀釋及細(xì)胞洗滌液：稀釋或洗滌細(xì)胞不可使用含鈣離子、鎂離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。

5. 注意添加順序：樣品在上，分離液在下，保持兩液面界面清晰。

6. 離心管：選用玻璃材質(zhì)離心管。部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。

7. 離心：血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(huì)影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索適宜的分離條件。

   如何選擇細(xì)胞分離液產(chǎn)品？ 

1.要有針對(duì)性地選擇產(chǎn)品。不同細(xì)胞的密度與體積是不同的，不同種屬動(dòng)物細(xì)胞的密度也是不同的。索萊寶針對(duì)不同客戶科研需求，研發(fā)了不同種細(xì)胞的分離液，如：淋巴細(xì)胞分離液、粒細(xì)胞分離液、白細(xì)胞分離液和單個(gè)核細(xì)胞分離液；針對(duì)不同種屬動(dòng)物，研發(fā)了不同動(dòng)物的細(xì)胞分離液，如：人、小鼠、大鼠、雞、兔、牛、狗等等。同時(shí)，索萊寶細(xì)胞分離液系列產(chǎn)品滿足了外周血、組織臟器、骨髓等不同樣品的分離。索萊寶豐富多樣的產(chǎn)品滿足了客戶的多種科研需求。2. 要選擇分層效果明顯的產(chǎn)品。索萊寶細(xì)胞分離液產(chǎn)品，性價(jià)比高，分層效果明顯。以人外周血淋巴細(xì)胞分離液為例，索萊寶分離液產(chǎn)品分離的白膜層非常清晰，而且白膜層沒(méi)有彌散，效果優(yōu)于其他品牌同類產(chǎn)品。3.要選擇細(xì)胞沉淀純度高的產(chǎn)品。使用索萊寶的細(xì)胞分離液產(chǎn)品得到的淋巴細(xì)胞較為純凈，紅細(xì)胞污染極少，純度大于90%。比其他品牌分離液分離的效果都好。

千辛萬(wàn)苦得到的細(xì)胞

以為大功告成？

接下來(lái)是細(xì)胞培養(yǎng)

*長(zhǎng)征才剛剛開(kāi)始

稍不注意

一下回到解放前！

    細(xì)胞培養(yǎng)要注意哪些？   

無(wú)菌的環(huán)境與操作：在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，應(yīng)保持無(wú)菌的實(shí)驗(yàn)環(huán)境并進(jìn)行無(wú)菌操作。

培養(yǎng)液的選擇：每種細(xì)胞應(yīng)該選擇適合它的培養(yǎng)液。索萊寶的多種細(xì)胞培養(yǎng)液產(chǎn)品滿足了不同細(xì)胞的需求。

溫度與pH值的監(jiān)控：一般選擇37℃和5% CO2培養(yǎng)體系。細(xì)胞培養(yǎng)液偏黃色的時(shí)候應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)液。

預(yù)熱培養(yǎng)液：為了使細(xì)胞更好地貼壁，應(yīng)注意提前預(yù)熱培養(yǎng)液。

避免培養(yǎng)液暴露在熒光下：平時(shí)應(yīng)注意將培養(yǎng)液儲(chǔ)存在黑暗的環(huán)境中，熒光（紫外光）對(duì)于培養(yǎng)液（有細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞）有不利影響。

傳代接種密度：在細(xì)胞傳代的過(guò)程中要保證合適的接種密度。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)控制細(xì)胞傳代的接種密度。同時(shí)，要注意觀察細(xì)胞的狀態(tài)和生長(zhǎng)速度。

避免細(xì)胞損傷：在細(xì)胞消化傳代時(shí)，應(yīng)注意胰蛋白酶的濃度以及消化的時(shí)間。輕柔地吹打細(xì)胞，避免機(jī)械損傷，選擇適當(dāng)?shù)碾x心力。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：凍存液中要加入保護(hù)劑：甘油或二甲基亞砜（DMSO）。凍存時(shí)要進(jìn)行梯度降溫。細(xì)胞復(fù)蘇選擇在37℃的水溶液中進(jìn)行，解凍細(xì)胞速度要快。解凍后，細(xì)胞凍存管外壁要用紙擦干，避免污染。

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總得來(lái)說(shuō)

細(xì)胞分離和培養(yǎng)是個(gè)細(xì)致活

方方面面都需您注意

希望這些要點(diǎn)可以幫助到您！

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