酪氨酸酶：

從酶學(xué)性質(zhì)到

抑制劑篩選的全面解析

---SOLARBIO---

酪氨酸酶（Tyrosinase，EC1.14.18.1）在美白、治療色素沉著性疾病、果蔬保鮮等領(lǐng)域，一直是研究的熱門(mén)靶點(diǎn)，最近研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶甚至在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕。┲邪缪葜匾巧?。作為黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，其活性調(diào)控機(jī)制、體外檢測(cè)方法以及抑制劑篩選模型的建立都至關(guān)重要。本文系統(tǒng)梳理酪氨酸酶的分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制、活性檢測(cè)方法以及抑制劑篩選策略。

一、酪氨酸酶：

黑色素合成的“限速引擎"

酪氨酸酶是一種含銅離子的多酚氧化酶，屬于I型跨膜糖蛋白，在黑色素細(xì)胞的黑素小體膜上定位。

01

結(jié)構(gòu)與活性中心

酪氨酸酶的活性中心由兩個(gè)保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)（CuA和CuB）構(gòu)成，每個(gè)銅離子與組氨酸殘基配位。兩個(gè)銅離子在氧分子的參與下，共同構(gòu)成催化氧化反應(yīng)的活性中心。

（1）氧化態(tài)（Eoxy）：與O?結(jié)合，催化羥基化反應(yīng)

（2）還原態(tài)（Emet）：參與后續(xù)的氧化反應(yīng)

02

催化雙重反應(yīng)

（1）單酚酶活性（Monophenolase）：催化酪氨酸羥化為多巴（L-DOPA）

（2）二酚酶活性（Diphenolase）：催化多巴進(jìn)一步氧化為多巴醌

多巴醌隨后通過(guò)非酶促反應(yīng)或由TRP1、TRP2等酶催化，最終生成真黑色素或褐黑色素。

TYR，tyrosinase，酪氨酸酶； TRP，tyrosinase related protein，酪氨酸酶相關(guān)蛋白； Dopa，多巴，3,4-二羥基苯丙氨酸； DHICA，5,6-二羥基吲哚-2-羧酸； DHI，5,6-二羥基哚哚； ICAQ，吲哚-2-羧酸-5,6-醌； IQ，吲哚-5,6-二酮； HBTA，5-羥基-1,4-苯并噻嗪丙氨酸。（Chang TS., 2009）

03

酪氨酸酶的表達(dá)與分布

酪氨酸酶廣泛存在于微生物、植物、無(wú)脊椎及脊椎動(dòng)物中，不同來(lái)源的酶在結(jié)構(gòu)、底物特異性和表達(dá)水平上存在顯著差異。

哺乳動(dòng)物

主要表達(dá)于黑色素細(xì)胞的黑素小體內(nèi)，由TYR基因編碼，為I型跨膜糖蛋白。人、小鼠等哺乳動(dòng)物的酪氨酸酶與蘑菇酶在糖基化模式、最適pH及底物親和力（對(duì)L-酪氨酸 vs L-多巴）上均有差異，因此蘑菇酶雖常用于高通量篩選，但候選抑制劑需經(jīng)哺乳動(dòng)物酶驗(yàn)證。

蘑菇（如雙孢蘑菇）

是商品化酪氨酸酶的主要來(lái)源，因含量高、易提取、活性穩(wěn)定而被廣泛用作體外篩選模型。蘑菇酶為胞內(nèi)可溶性蛋白，無(wú)需膜蛋白純化步驟，成本低廉。

植物

在部分水果（如蘋(píng)果、香蕉、馬鈴薯）中參與褐變反應(yīng)，其表達(dá)受機(jī)械損傷、病原侵染等誘導(dǎo)，是食品保鮮研究的重要靶點(diǎn)。

昆蟲(chóng)

酪氨酸酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)參與表皮黑化、傷口愈合及免疫防御，與昆蟲(chóng)的酚氧化酶（PO）同源，是開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的潛在靶點(diǎn)。

二、酪氨酸酶抑制劑：

黑色素合成的“剎車(chē)系統(tǒng)"

酪氨酸酶抑制劑通過(guò)干擾酶的催化活性或降低其表達(dá)水平，從而減少黑色素生成。根據(jù)作用機(jī)制與化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將其分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及混合型抑制劑等類(lèi)型。

01. 按作用機(jī)制分類(lèi)如下表：

02. 酪氨酸酶抑制劑的篩選

在酪氨酸酶抑制劑篩選、酶動(dòng)力學(xué)研究以及產(chǎn)品功效評(píng)價(jià)中，建立穩(wěn)定、靈敏、可重復(fù)的酶活性檢測(cè)體系是基礎(chǔ)。

2.1 底物檢測(cè)原理

L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，多巴經(jīng)酪氨酸酶催化生成多巴醌，多巴醌在475nm處有吸收峰，加入酪氨酸酶抑制劑后可以抑制多巴醌的生成，據(jù)此可以計(jì)算出酪氨酸酶抑制率。

2.2 實(shí)驗(yàn)體系建立要點(diǎn)

pH值：酪氨酸酶最適pH一般在6.8左右，pH偏離會(huì)導(dǎo)致酶活顯著下降；

溫度：最適溫度約25-37℃，過(guò)高溫度易導(dǎo)致酶失活；

酶濃度與底物濃度：需提前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定線性反應(yīng)區(qū)間，避免底物飽和或酶過(guò)量導(dǎo)致的動(dòng)力學(xué)失真。

03. 抑制劑篩選策略：從初篩到機(jī)制驗(yàn)證

3.1 酶活抑制率測(cè)定

采用96孔板高通量模式，設(shè)置不同濃度待測(cè)物，計(jì)算IC??值。同步設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（如曲酸、熊果苷、苯乙基間苯-二酚等已知抑制劑），以評(píng)估體系的可靠性。

3.2 機(jī)制研究：酶動(dòng)力學(xué)分析

通過(guò)改變底物濃度或酶濃度，測(cè)定不同抑制劑濃度下的反應(yīng)速率，繪制LineweaverBurk雙倒數(shù)圖，判斷抑制類(lèi)型：

（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心（如熊果苷），表現(xiàn)為K_m增大，V_max不變。

（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑結(jié)合于酶的非活性中心位點(diǎn)（如部分多酚類(lèi)化合物），表現(xiàn)為K_m不變，V_max減小。

（3）混合型抑制：兼具兩種特性，K_m增大，V_max減小。

三、酪氨酸酶和酪氨酸酶

抑制劑的應(yīng)用領(lǐng)域以及研究方向

1、化妝品美白，皮膚醫(yī)學(xué)黃褐斑、雀斑、炎癥后色素沉著等疾病的治療藥物開(kāi)發(fā)；

2、食品保鮮抑制果蔬（如蘑菇、馬鈴薯、蘋(píng)果）的酶促褐變，延長(zhǎng)貨架期；

3、生物農(nóng)藥針對(duì)昆蟲(chóng)酪氨酸酶（參與蟲(chóng)體黑化及免疫）的殺蟲(chóng)劑設(shè)計(jì)；

4、生物傳感器基于酪氨酸酶的電化學(xué)傳感器，用于酚類(lèi)污染物檢測(cè)；

5、其他新興方向：酪氨酸酶在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕。┲袇⑴c神經(jīng)黑色素生成；在合成生物學(xué)中用于構(gòu)建色素生產(chǎn)途徑。（Nagatsu, Toshiharu et al., 2022）

酪氨酸酶作為黑色素合成的核心酶，其活性調(diào)控機(jī)制、檢測(cè)方法及抑制劑篩選模型的建立，是色素相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的基石。在抑制劑的研發(fā)實(shí)踐中，需綜合考慮提取方法、檢測(cè)體系、抑制機(jī)制等多維度因素，才能篩選出兼具高效性與安全性的候選分子。

結(jié)合前文蛋白酶的分類(lèi)與應(yīng)用，

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參考文獻(xiàn)

[1] Chang TS. An updated review of tyrosinase inhibitors. Int J Mol Sci. 2009;10(6):2440-2475. Published 2009 May 26. doi:10.3390/ijms10062440

[2] Nagatsu, Toshiharu et al. “Neuromelanin in Parkinson's Disease: Tyrosine Hydroxylase and Tyrosinase." International journal of molecular sciences vol. 23,8 4176. 10 Apr. 2022, doi:10.3390/ijms23084176