小分子化合物抑制劑已成為藥物研發(fā)、靶點驗證以及機(jī)制性細(xì)胞生物學(xué)中不可-或缺的工具。它們能夠以時間上的精確性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，這相較于基因方法具有優(yōu)勢。然而，一個長期存在且常常被低估的問題威脅著無數(shù)研究的準(zhǔn)確性——脫靶效應(yīng)。

脫靶效應(yīng)指的是小分子與除其主要預(yù)期靶點之外的其他蛋白質(zhì)發(fā)生意外的相互作用。這些相互作用可能會產(chǎn)生混亂的數(shù)據(jù)、假陽性表型，并最終導(dǎo)致不可重復(fù)的結(jié)果。接下來將詳細(xì)介紹脫靶效應(yīng)為何會發(fā)生、如何檢測它們，以及最重要的是如何利用實用的實驗策略和已充分表征的工具化合物來控制它們。

在實驗研究中，可靠的結(jié)果不僅取決于化合物本身，還取決于試劑的質(zhì)量、驗證方法以及實驗系統(tǒng)的支持。這就是Solarbio所發(fā)揮價值的地方。憑借在小分子化合物及靶點驗證服務(wù)方面的豐富經(jīng)驗，Solarbio為研究人員提供幫助，助力他們獲取更清晰的數(shù)據(jù)，并在篩選和驗證過程中減少未知變量的影響。

導(dǎo)致脫靶效應(yīng)原因是什么？

了解脫靶效應(yīng)原因是減輕這種效應(yīng)的第一步。

1.小分子化合物抑制劑的多靶點作用

許多小分子化合物抑制劑，尤其是激酶抑制劑，具有內(nèi)在的多靶點特性——即能夠與多個靶點結(jié)合。激酶具有高度保守的 ATP 結(jié)合口袋，這使得選擇性抑制變得困難?？此铺囟ǖ谋硇蛯嶋H上可能是由幾種相關(guān)酶的同時調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的。

例如：

Cat：IS1270 SP600125

廣泛使用的 JNK 抑制劑 SP600125還能有效抑制 PI3Kδ 和 S6K1，從而在免疫細(xì)胞研究中容易引入錯誤研究結(jié)果。

SP600125

2. 小分子化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)驅(qū)動的多效性

某些化學(xué)基團(tuán)會促進(jìn)非特異性結(jié)合。疏水基團(tuán)、芳香環(huán)和帶電基團(tuán)能夠與脂質(zhì)膜或血清蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞內(nèi)有效濃度。計算得出的 LogP 值（脂溶性）較高的化合物尤其容易聚集和非特異性地與蛋白質(zhì)結(jié)合。

Cat：IC3910  Clofazimine

Clofazimine具有多環(huán)芳香共軛體系和氯原子取代的強(qiáng)疏水骨架，LogP值高，使其極易與脂質(zhì)膜和血清蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合。

Clofazimine

3. 濃度依賴性選擇性

選擇性并非一種絕對的固有屬性；相反，它與濃度密切相關(guān)。在 10 nM 時極其具有選擇性的化合物，在 10 µM 時可能會抑制數(shù)十種非靶點。許多研究人員在不知情的情況下使用了濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其選擇性范圍的抑制劑，無意中引入了干擾性作用。

Cat：IA1740  Aliertib

Aliertib在nM下是高度選擇性的Aurora A激酶抑制劑，但在μM 水平下會脫靶抑制多種其他激酶（如 FLT3）或影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白。

Aliertib

脫靶效應(yīng)如何破壞實驗有效性？

脫靶效應(yīng)很少會“自我宣告"。相反，它們會通過以下幾種方式悄無聲息地扭曲數(shù)據(jù)解讀。

細(xì)胞學(xué)檢測中的假陽性表型

活性小分子化合物可能通過線粒體毒性而非其預(yù)期靶點來降低細(xì)胞活力。細(xì)胞的形態(tài)變化也可能源于與研究通路無關(guān)的細(xì)胞骨架破壞。

檢測方法干擾

某些活性化合物會直接干擾檢測化學(xué)體系，從而導(dǎo)致得到錯誤的數(shù)據(jù)理論，影響實驗進(jìn)展。

Cat：IR1380 刃天青鈉

基于刃天青的細(xì)胞活力檢測易受具有氧化還原活性的化合物影響，這些化合物無論細(xì)胞代謝狀態(tài)如何，都能直接還原該染料。

刃天青鈉

作用機(jī)制的錯誤歸屬

在沒有進(jìn)行嚴(yán)格的脫靶分析的情況下，研究人員可能會錯誤地將某一表型歸因于特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或信號節(jié)點，從而導(dǎo)致后續(xù)研究工作的浪費以及不正確的生物學(xué)模型建立。

如何識破脫靶效應(yīng)？

早期發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)可以節(jié)省大量的后期工作，以下方法可以用來識別脫靶效應(yīng)。

01

劑量-反應(yīng)曲線（Dose-Response）

陡峭的、閾值依賴性的反應(yīng)通常表明化合物結(jié)合了單個高親和力靶點。相反，在寬濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)的平緩、廣譜反應(yīng)則可能提示多藥理作用。在選定工作濃度之前，務(wù)必先建立完整的劑量-反應(yīng)曲線。

02

正交驗證（Orthogonal Validation）

單一檢測方法不足以確立化合物的靶向作用機(jī)制。應(yīng)至少采用兩種機(jī)制上相互正交的檢測策略進(jìn)行交叉驗證。

基因水平正交驗證

·多組 sgRNA/shRNA交叉敲低

針對同一靶基因設(shè)計 3 條及以上 不同序列的 sgRNA 或 shRNA。若僅其中 1 條產(chǎn)生表型，而其余均無一致表型，則可判定該表型極大概率源于脫靶效應(yīng)。

·CRISPR 敲除 + RNA 干擾雙重驗證

聯(lián)合使用 CRISPR 介導(dǎo)的基因敲除（DNA 水平）與慢病毒 shRNA 介導(dǎo)的基因敲低（RNA 水平）。若兩種方法所得表型不一致，提示存在脫靶效應(yīng)。

·全基因組脫靶測序（CIRCLE-seq / Digenome-seq）

在體外及細(xì)胞內(nèi)水平高通量掃描全基因組潛在錯配切割位點，直接定位脫靶基因，是目前公-認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)"正交驗證方法。

·轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）差異基因比對

比較干預(yù)組（藥物或基因操作）與對照組的轉(zhuǎn)錄組差異，排除非目標(biāo)通路的異常激活，從而系統(tǒng)篩查大范圍的脫靶表達(dá)擾動。

蛋白/功能水平正交驗證

·靶點抑制劑 + 基因敲除雙向?qū)φ?/strong>

比較小分子抑制劑處理與靶基因純合敲除后的生物學(xué)表型及功能指標(biāo)。若兩者結(jié)果不一致，則提示該藥物存在顯著脫靶作用。

·靶點過表達(dá)回補(bǔ)實驗

在敲低或敲除靶基因后，回補(bǔ)一個對原干預(yù)方式不敏感的耐藥型靶基因突變體。若表型未能恢復(fù)，則說明觀察到的效應(yīng)來源于脫靶，而非靶點本身。

·同源蛋白家族交叉活性檢測

細(xì)胞與表型正交驗證

·不同細(xì)胞系平行驗證

在野生型細(xì)胞、靶基因缺失型細(xì)胞及同源基因高表達(dá)細(xì)胞中同步開展實驗。若表型在不同細(xì)胞系間差異過大，可判定存在脫靶效應(yīng)。

·陰性對照細(xì)胞株驗證

使用靶基因純合敲除的細(xì)胞株進(jìn)行藥物處理。若該細(xì)胞仍出現(xiàn)明顯的藥效或表型，則直接證明該藥物存在較強(qiáng)的脫靶效應(yīng)。

·濃度梯度效應(yīng)擬合

通過高低不同濃度梯度檢測功能響應(yīng)曲線。若在低濃度下觀察到靶向起效，而在高濃度下出現(xiàn)異常表型，則提示高濃度易誘發(fā)脫靶效應(yīng)。

如何控制脫靶效應(yīng)？

一旦識別出脫靶效應(yīng)，可采用以下策略進(jìn)行控制脫靶效應(yīng)。

 使用多種結(jié)構(gòu)不同的抑制劑

不應(yīng)僅依賴任何一種單一的抑制劑。使用兩種或以上具有不同骨架但靶向同一蛋白的抑制劑，可以大大降低共享脫靶假象的風(fēng)險。

例如：

在進(jìn)行BTK相關(guān)研究時，建議將Evobrutinib（CAS: 1415823-73-2）與Acalabrutinib（CAS: 1420477-60-6）或Zanubrutinib（CAS: 1691249-45-2）聯(lián)合使用，通過表型一致性驗證以增強(qiáng)結(jié)論的可靠性。

Cat：IE1230  Evobrutinib

Cat：IA0780  Acalabrutinib

Cat：IZ0570  zanubrutinib

 設(shè)置陰性對照化合物

應(yīng)采用無活性的結(jié)構(gòu)類似物或立體異構(gòu)體作為陰性對照。

例如：

在驗證EGFR依賴性表型時，不應(yīng)僅依賴單一抑制劑。建議聯(lián)用兩種具有不同骨架和作用機(jī)制的抑制劑：共價（不可逆）EGFR抑制劑Osimertinib（CAS: 1421373-65-0，嘧啶骨架，靶向T790M突變）與可逆性EGFR抑制劑Gefitinib（CAS: 184475-35-2，喹唑啉骨架）。若兩種抑制劑能產(chǎn)生一致的表型效應(yīng)，則可更有力地證明該效應(yīng)源于對EGFR靶點的特異性作用，而非共同的脫靶效應(yīng)。

Cat：IO0820 Osimertinib

Cat：IG0060 Gefitinib

 開展洗脫實驗

若表型在化合物去除后可逆轉(zhuǎn)，則支持該化合物通過直接、可逆的方式與靶點結(jié)合。若洗脫后效應(yīng)仍持續(xù)存在，則提示可能由細(xì)胞毒性或不可逆的脫靶修飾所導(dǎo)致。

 優(yōu)化給藥方案

務(wù)必在已確認(rèn)的選擇性窗口內(nèi)進(jìn)行劑量設(shè)計。應(yīng)確定最-低有效濃度（MEC），避免默認(rèn)使用高微摩爾濃度的劑量。條件允許時，建議采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定細(xì)胞內(nèi)化合物水平以進(jìn)行確認(rèn)。

高選擇性小分子化合物

下表列出了經(jīng)過文獻(xiàn)驗證、具有高選擇性的小分子抑制劑，適用于精確的信號通路解析。