糜*白酶活性檢測(cè)
試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
貨號(hào)：BC2335
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前溶于1.6 mL甲醇中，再用水定容至10 mL?？煞盅b后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：
糜*白酶，又稱(chēng)胰凝*蛋白酶，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)。糜*白酶的功能與胰蛋*酶相似，但是具有分解能力強(qiáng)、毒性低和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。臨床上糜*白酶用于痰液稀化，對(duì)膿性和非膿性痰液均有效；也用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合，如白內(nèi)障摘除。
糜*白酶催化BTEE水解，產(chǎn)物在256nm有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定256nm光吸收增加速率，來(lái)計(jì)算糜*白酶活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）1：5-10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清即粗酶液。

2. 血清（漿）：直接檢測(cè)。

• 測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至256nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于25℃水浴中保溫30min。

3. 樣本測(cè)定：

將上述試劑分別加入微量石英比色皿/96孔UV板后充分混勻，于256nm處測(cè)定初始吸光值A1和3min時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

• 糜*白酶活性計(jì)算公式

1. 按微量石英比色皿計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘水解1μmol BTEE為一個(gè)酶活單位。
糜*白酶活(U/mg prot)=(ΔA×V反總÷ε÷d) ÷(Cpr×V樣)÷T=3.8×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃每克樣本每分鐘水解1μmol BTEE為一個(gè)酶活單位。
糜*白酶活(U/g 質(zhì)量)= (ΔA×V反總÷ε÷d) ÷(W×V樣÷V 提取)÷T=3.8×ΔA÷W

1. 按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃每毫升血清（漿）每分鐘水解1μmol BTEE為一個(gè)酶活單位。
糜*白酶活(U/mL )=(ΔA×V反總÷ε÷d)÷V樣÷T=3.8×ΔA
V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，0.02mL；Cpr：粗酶液蛋白濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；V反總：反應(yīng)總體積，0.22mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；ε：BTEE消光系數(shù)，0.964mL/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm。

1. 按96孔UV板計(jì)算：

將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。
注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)ΔA大于0.15或者吸光值大于1時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，注意計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 當(dāng)ΔA小于0.04時(shí)，建議將樣本濃縮或者增加樣本體積進(jìn)行測(cè)定，注意計(jì)算公式除以濃縮倍數(shù)或者改變體積。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔腎臟加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清后再用提取液稀釋10倍，之后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=A2-A1=0.9955-0.9192=0.0763，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：糜*白酶活(U/g 質(zhì)量)=3.8×ΔA÷W×10（稀釋倍數(shù)）=28.994 U/g 質(zhì)量。

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