維生素B1（VB1）含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號: BC4195
規(guī)格: 100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
1、提取液：內含不溶物，使用前搖勻；
2、標準品：10mg維生素B1。臨用前加入1mL稀釋液，配成10mg/mL（即10000µg/mL）的標準液。
產品說明：
維生素B1（Vitamin B1）又稱硫胺素，以輔酶形式參與糖的分解代謝，在生物體能量代謝中有重要的作用。

VB1在堿性條件下還原鐵*生成亞鐵*，亞鐵*與Fe³⁺在弱酸條件下生成普魯士藍，測定布魯士藍在704nm下的特征吸收峰，即可反映VB1的含量。

技術指標：
低檢出限：0.057 µg/mL
線性范圍：1.953-250 µg/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟：

• 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：將樣本磨碎，按照質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000g離心10min，取上清測定（動物組織、豆類種子等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘或反復離心2-3次至上清無渾濁）。
2、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000g離心10min，取上清測定。
3、液體：直接檢測。
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至704nm，分光光度計蒸餾水調零。

2. 將10mg/mL（10000µg/mL）標準液用稀釋液稀釋為250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μg/mL的標準溶液備用。

3. 標準品稀釋表

實驗中每個標準管需25µL標準溶液。

1. 操作表（在1.5mL EP管中進行下列操作）：

三、維生素B1含量計算
1、標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得x（μg/mL）。
2、維生素B1含量的計算：
（1）按蛋白濃度計算：VB1（μg/mg prot）=x×V樣總÷（Cpr×V樣總）= x÷Cpr
（2）按樣本質量計算：VB1（μg/g 質量）=x×V樣總÷W = x÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算：VB1（μg/10⁴ cell）= x×V樣總÷細胞數(shù)量（萬個）= x÷細胞數(shù)量（萬個）
（4）按液體體積計算：VB1（μg/mL）= x
V樣總：樣本總體積，1mL； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

2. 蛋白濃度較高的樣本，比如動物組織，豆類種子等建議將樣本稀釋20倍或40倍后再測定并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 顯色完成后立即進行測定，若顯色完成后有沉淀產生，將其搖勻后測定。

實驗實例：

1. 稱取0.1g肝臟，加入0.6mL提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000rpm離心10min，取上清，將上清稀釋40倍之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA= A測定管-A空白管=0.551-0.107=0.444，帶入標準曲線y=0.0054x+0.0043，計算x=81.43μg/mL，按樣本質量計算VB1含量得：

VB1（μg/g質量）= x×V樣總÷W×40（稀釋倍數(shù)）=81.43×1÷0.1×40=32572 μg/g 質量。

1. 稱取0.1g稗草，加入0.6mL提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000rpm離心10min，取上清，將上清稀釋40倍之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA= A測定管-A空白管=0.727-0.107=0.62，帶入標準曲線y=0.0054x+0.0043，計算x =114.02 μg/mL，按樣本質量計算VB1含量得：

VB1（μg/g質量）= x×V樣總÷W×40（稀釋倍數(shù)）=114.02×1÷0.1×40=45608 μg/g 質量。
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