脂蛋白酯酶（LPL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC2445

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入1mL丙酮溶解備用，用不完的試劑-20℃保存4周。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5 μmol/mL對硝基苯*標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前取30μL 5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，加入450μL試劑一，充分混勻，配制成0.3125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配（實(shí)驗(yàn)中每管需要30μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積）。

產(chǎn)品說明：

脂蛋白酯酶（Lipoproteinlipase，LPL）是甘油三酯降解的降速酶，可催化甘油三酯水解為脂肪酸和單酸甘油酯，主要在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，在脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生4-硝基苯*，在400nm有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫臺式離心機(jī)、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、EP管、冰、丙酮和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣本：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：在1.5mL EP管中進(jìn)行下列操作：

三、LPL活性計算

1、血清（漿）LPL活力計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/mL）=ΔA÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LPL活力計算

（1）按樣本質(zhì)量計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷W÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/mg prot）=ΔA÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷（V提取×Cpr）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位定義：在45℃，pH7.5條件下，每10⁴個細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。

LPL（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V提取÷N÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.3125μmol/mL；V提取：加入試劑一體積，1mL；T：反應(yīng)時間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以萬計；1000：單位換算系數(shù)，1μmol=1000nmol。

注意事項：

1、 測定管加入試劑二后混變渾濁為正常現(xiàn)象。

2、 若A大于2，將粗酶液用試劑一稀釋后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL試劑一，取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管- A對照管=0.367-0.128=0.239，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.378-0.046=0.332，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

LPL（U/g 質(zhì)量）= 31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=31.25×0.239÷0.332÷0.1=224.96 U/g 質(zhì)量。

2、 取兔血清直接按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA=A測定管- A對照管=0.750-0.152=0.598，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.378-0.046=0.332，按血清（漿）體積計算酶活得：

LPL（U/mL）=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=31.25×0.598÷0.332=56.29 U/mL。

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