乙酰輔酶羧化酶（ACC）活性檢測(cè)試劑盒（酶法）說(shuō)明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。

貨號(hào)：BC6025

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1．提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存。

2．提取液的配制：按提取液一：提取液二=990μL：10μL的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。

3．試劑一：臨用前將試劑一B全部倒入試劑一A，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

4．試劑二：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入5 mL蒸餾水，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

5．試劑三稀釋液：臨用前離心，根據(jù)樣本量按照試劑三：蒸餾水=1μL：50μL（共51μL，約5T）的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

6．試劑四稀釋液：臨用前離心，根據(jù)樣本量按照試劑四：蒸餾水=1μL：125μL（共126μL，約12T）的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7．試劑五：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入5 mL蒸餾水；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

8．試劑六：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入5 mL蒸餾水；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

9．工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑三稀釋液：試劑四稀釋液：試劑五：試劑六=50μL:50μL:200μL:200μL（共500μL，約5T）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

乙酰輔酶羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶羧化生成丙二酰輔酶，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC能夠催化乙酰輔酶、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶、ADP和無(wú)機(jī)磷，丙 酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映ACC活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、分析天平、低溫離心機(jī)、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、漩渦震蕩儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：具體的操作步驟請(qǐng)見“產(chǎn)品資料"文件

注意事項(xiàng)：

1、 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋

中，在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

2、 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、 當(dāng)A1測(cè)定空白時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定；當(dāng)樣本?A過(guò)小時(shí)，建議增大樣本量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，注意同步修改計(jì)算公式。

4、 由于提取液一中含有蛋白（約1mg/mL），若需要測(cè)定樣本的蛋白濃度，需要減去提取液本身的蛋白濃度。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1044g小鼠腦組織，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（0.828-0.162）-（0.788-0.774）=0.652，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/g 質(zhì)量）=535.9×?A÷W=3346.8 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1041g向日葵葉片組織，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（0.841-0.811）-（0.788-0.774）=0.016，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/g 質(zhì)量）=535.9×?A÷W=82.37 U/g 質(zhì)量。

3. 取3×10⁶個(gè)Raw細(xì)胞，加入1mL提取液，進(jìn)行勻漿、離心、取上清，之后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（0.655-0.557）-（0.788-0.774）=0.084，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/10⁶ cell）=535.9×?A÷N=15.01 U/10⁶ cell。

4. 取30μL兔血清，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA=（A1測(cè)定-A2測(cè)定）-（A1空白-A2空白）=（0.846-0.810）-（0.788-0.774）=0.022，按樣本血清（漿）體積計(jì)算酶活得：

ACC酶活（U/mL）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷V樣÷T=178.63?×A=3.93U/mL

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