蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5795

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制，勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

4、 0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，存在于一切生物體內(nèi)，是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)。二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中，兩個(gè)不同半胱氨*殘基的巰基的化學(xué)鍵。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響很大，在蛋白質(zhì)分子中，起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用，所以測(cè)定蛋白質(zhì)二硫鍵含量尤為重要。

還原劑會(huì)使二硫鍵裂解，裂解后的巰基會(huì)發(fā)生親核反應(yīng)，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、研缽/勻漿器、丙酮（AR）、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請(qǐng)緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時(shí)間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請(qǐng)緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：若測(cè)定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計(jì)算公式）。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：（建議在2mL的EP管中操作）

三、蛋白質(zhì)二硫鍵含量的計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mg prot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷2×F

=0.0625× ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷W÷2×F

=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照液體體積計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mL）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷V液樣÷2×F

=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

4. 按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol /10⁶ cell）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷N÷2×F
=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定，可以使用BCA方法測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；V試劑一：提取時(shí)加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時(shí)加入的樣本體積，0.1mL；2：一個(gè)二硫鍵裂解產(chǎn)生兩個(gè)巰基；F：稀釋倍數(shù)；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù)，以10⁶計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 若樣本Δ測(cè)定A<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式；若樣本ΔA測(cè)定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取100μL馬血清，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.348-0.113）-（0.047-0.045）=0.233，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本液體體積計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/mL）= 1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F =0.933μmol/mL。

2、 取0.1036g鼠肝，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.475-0.107）-（0.261-0.105）=0.212，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.820μmol/g 質(zhì)量。

3、 取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.762-0.084）-（0.123-0.070）=0.625，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.417-0.105=0.312，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得：

蛋白質(zhì)二硫鍵含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =4.646μmol/g 質(zhì)量。

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