精*酸酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5555

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二和試劑五為易揮發(fā)試劑，用完及時(shí)擰蓋封口。

2、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990µL：10µL（1T）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中。

3、 試劑一：臨用前加入3.2mL試劑二，充分溶解，請(qǐng)勿放置于-20℃保存。2-8℃可保存4周

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：1mol/L（即1000μmol/mL）尿素標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

*酸酶（Arginase）又稱L*酸尿素水解酶或*氨酸脒基水解酶，是一種錳金屬酶。精*酸酶存在于細(xì)菌、酵母、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，并被認(rèn)為最早出現(xiàn)在細(xì)菌中。微生物體內(nèi)的*酸酶其主要功能可能是參與維持L-精*酸的動(dòng)態(tài)平衡，并參與調(diào)控多種重要代謝過(guò)程。

*酸酶將L-精*（L-arginine）分解為L-鳥(niǎo)*酸（L-ornithine）和尿素（urea），尿素與α-異亞硝基*丙酮反應(yīng)生成560nm處存在吸收峰的衍生物，通過(guò)測(cè)定尿素的生成量，可計(jì)算得到*酸酶活性大小。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋為50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需48µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、精*酸酶活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}（y，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA_測(cè)定代入方程得到x（μmol/mL）。

2. 精*酸酶活計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：37℃每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個(gè)酶活力單位。

精*酸酶活性（U/mg prot）=x×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×F= x÷30÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個(gè)酶活力單位。

精*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×F= x÷30÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

單位的定義：37℃每10⁶個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol尿素定義為一個(gè)酶活力單位。

精*酶活性（U/10⁶ cell）= x×V_樣÷（N÷V_樣總×V_樣）÷T×F= x÷30÷N×F

V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.048mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目，以10⁶計(jì)； F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、 如果測(cè)定吸光值大于1.5或?_測(cè)定大于0.7，可以對(duì)樣本進(jìn)行稀釋或者縮短第一步37℃反應(yīng)時(shí)間；測(cè)定吸光值或?_測(cè)定過(guò)小，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)第一步37℃反應(yīng)時(shí)間。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1198g小鼠腎臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.425-0.102=0.323，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0168x-0.0541（R² = 0.9941），x=22.446 μmol/mL，帶入公式計(jì)算：

精*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x÷30÷W×F =6.245 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.0989g胡蘿卜，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.086-0.063=0.023，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0168x-0.0541（R² = 0.9941），x=4.5893 μmol/mL，帶入公式計(jì)算：

*酸酶活性（U/g 質(zhì)量）= x÷30÷W×F=1.547 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen H, Mccaig B C, Melotto M, et al. Regulation of Plant Arginase by Wounding, Jasmonate, and the Phytotoxin Coronatine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(44):45998-46007.

[2] Ishii N, Ikenaga H, Carmines P K, et al. High glucose augments arginase activity and nitric oxide production in the renal cortex[J]. Metabolism, 2004, 53(7):868-874.

[3] Zharikov S, Krotova K, Hu H, et al. Uric acid decreases NO production and increases arginase activity in cultured pulmonary artery endothelial cells[J]. American Physiological Society, 2008(5). 

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