碳酸酐酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5445

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：試劑放于試劑瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中。臨用前取一支試劑二，加入200μL丙酮充分震蕩溶解，-20℃可以分裝保存1周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑二工作液：臨用前按試劑二：蒸餾水=20μL：480μL（12T）的比例進(jìn)行混合配制成試劑二工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少。 

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取100μL的5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入700μL蒸餾水充分混合，配制成0.625 μmol/mL的酚標(biāo)準(zhǔn)液。 

產(chǎn)品說(shuō)明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以Zn²⁺為活性中心的金屬酶，可用來(lái)高效催化CO₂的可逆水合反應(yīng)：CO₂+H₂O?HCO₃^-+H⁺，催化速率可達(dá)自然條件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸對(duì)硝基苯酯反應(yīng)生成對(duì)硝基苯*，通過(guò)檢測(cè)405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、液體：直接測(cè)定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測(cè)定)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)管的測(cè)定：在微量玻璃比色皿/96孔板加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，180μL試劑一，充分混勻后于405nm處測(cè)定吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)}。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)空白管的測(cè)定：在微量玻璃比色皿/96孔板加入20μL蒸餾水，180μL試劑一，充分混勻后于405nm處測(cè)定吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。

（3） 計(jì)算?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

3、 操作表：（在微量玻璃比色皿或者96孔板內(nèi)依次加入下列試劑）

按照加樣表依次在微量玻璃比色皿/96孔板加入上述試劑，充分混勻后于405nm處測(cè)定10s時(shí)的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱5min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至37℃），拿出迅速擦干測(cè)定5min10s時(shí)的吸光值A2。計(jì)算A_測(cè)定=A2_測(cè)定-A1_測(cè)定，A_空白=A2_空白-A1_空白，?A =A_測(cè)定-A_空白。（空白管只需做1-2次。）

三、CA活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：37℃，每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 對(duì)硝基*酚定義為一個(gè)酶活力單位。

CA活性（U/mg prot）= C_標(biāo)×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_樣÷（V_樣×Cpr）÷T×F=0.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr ×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 對(duì)硝基*定義為一個(gè)酶活力單位。

CA活性（U/g 質(zhì)量）= C_標(biāo)×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_樣÷（V_樣÷V_樣總×W ）÷T×F=0.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 對(duì)硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。

CA活性（U/mL）= C_標(biāo)×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}× V_樣÷V_樣÷T×F=0苯.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.625μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.02mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

如果A1測(cè)定大于0.5或者?A大于1，可以用蒸餾水對(duì)樣本進(jìn)行稀釋或者縮短37℃酶促反應(yīng)時(shí)間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)37℃酶促反應(yīng)時(shí)間。注意計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1029g小鼠肝臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，將上清稀釋40倍后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算A_測(cè)定=A2_測(cè)定-A1_測(cè)定=0.809-0.182=0.627，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測(cè)定-A_空白=0.587，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.627-0.047=0.58，帶入公式計(jì)算：

CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =49.177 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1058g娃娃菜葉片組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算A_測(cè)定=A2_測(cè)定-A1_測(cè)定=0.408-0.155=0.253，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測(cè)定-A_空白=0.213，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.627-0.047=0.58，帶入公式計(jì)算：

CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =0.868 U/g 質(zhì)量

3、 吸取20μL兔血清，稀釋2倍后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算A_測(cè)定=A2_測(cè)定-A1_測(cè)定=1.097-0.251=0.846，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.155-0.115=0.040，?A =A_測(cè)定-A_空白=0.806，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.627-0.047=0.58，帶入公式計(jì)算： 

CA活性（U/mL）=0.125×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F =0.347 U/mL

參考文獻(xiàn)：

[1] BROWNELL, P. F, BIELIG, et al. Increased Carbonic Anhydrase Activity in Leaves of Sodium-Deficient C4 Plants[J]. Functional Plant Biology, 1991, 18(6):589-592.

[2] A, V. Tavallali , et al. Zinc influence and salt stress on photosynthesis, water relations, and carbonic anhydrase activity in pistachio. Scientia Horticulturae, 2009, 123(2): 272-279.

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