動物組織中甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4985

規(guī)格：100T/96S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入0.25 mL蒸餾水，充分混勻；用不完的試劑-20℃分裝保存兩周，避免反復凍融。（1瓶粉劑溶解后可做100T，為了延長使用時間，此產品多給1瓶粉劑）

2、 試劑二工作液：根據(jù)試驗所需用量，按照試劑二（μL）∶蒸餾水（μL）=1∶29比例配成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。試劑二工作液當天配制當天用完。

3、 試劑三：臨用前加入0.6mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃分裝保存兩周。

產品說明：

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中，是一種將甲醛進行轉換的氧化還原酶。甲醛脫氫酶可催化甲醛和NAD⁺產生NADH，在340nm處的吸光值會增加，測定340nm處的吸光值變化，可計算得到甲醛脫氫酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照動物組織質量（g）：提取液體積（mL）=1∶5~10的比例（建議稱取0.1 g動物組織，加入1 mL提取液），冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清（若上清不夠澄清，建議重復上述離心步驟）置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調零。

2、 臨用前將試劑一、試劑四置于37℃預熱10 min。

3、 在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入 20 μL 樣本、110 μL試劑一、50 μL試劑二工作液、10 μL試劑三、10 μL試劑四，充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培養(yǎng)箱5min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定5min20s時的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。

三、動物組織中甲醛脫氫酶活性計算

A、按微量石英比色皿計算

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、按樣本質量計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F=321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol；F：稀釋倍數(shù)。

B、按96孔板（UV板）計算

將上述公式中d=1 cm變?yōu)?/span>d=0.6 cm，代入公式進行計算即可。

注意事項：

1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建議用提取液稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低，建議增加樣本量后再進行測定。

2、試劑四有毒性，實驗時請佩戴口罩手套等防護用具。

實驗實例：

1、 稱取0.1 g小鼠心臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A2-A1=0.6385-0.3807=0.2578，按公式計算小鼠心臟組織中甲醛脫氫酶活性：

FDH酶活（U/g 質量）=321.54×ΔA÷W×F=825.9 U/g 質量

2、 稱取0.1 g小鼠肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清稀釋10倍置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=A2-A1=0.2534-0.1699=0.0835，按公式計算小鼠肝臟組織中甲醛脫氫酶活性：

FDH酶活（U/g 質量）=321.54×ΔA÷W×F=2684.9 U/g 質量

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