北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學(xué)試劑及試劑盒領(lǐng)域
服務(wù)熱線：18101056239
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產(chǎn)品型號：BC5080-50T/24S
更新時間：2024-07-08
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：1233
010-50973130
產(chǎn)品分類
β-羥丁酸（β-HB）含量檢測試劑盒（WST法）說明書
可見分光光度法
貨號：BC5080
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體70mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
顯色液 | 液體4mL×1瓶 | -20℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前取一支加入1.5mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復(fù)凍融。
2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水（約40T），充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周。避免反復(fù)凍融。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 3-羥基丁酸鈉。臨用前加入980μL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4℃保存1個月。
4、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一、試劑二、試劑三按照850:40:10（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液在4h內(nèi)用完。
產(chǎn)品說明：
β-羥丁酸（β-HB），在嚴(yán)重酸中毒患者體內(nèi)，由于酸中毒使患者體內(nèi)NADH生成增加，進而促使β-羥丁酸與乙酰乙酸的比值自正常的2:1提高至16:1。β-羥丁酸在檢測糖尿病酮癥酸中毒診斷、治療中有重要意義，對糖尿病的早期診斷也有重要意義。本試劑盒適用于血清、血漿、尿液等樣本。
在pH8.8和37℃條件下，β-HB在β-羥丁酸脫氫酶（HBDH）催化下脫氫生成乙酞乙酸，同時NAD+被還原成NADH；在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰。通過檢測450nm下波長變化，可計算出β-HB的含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、 適用樣本
血清、血漿、尿液等樣本，直接檢測即可，若溶液有渾濁可離心后進行測定
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋至0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。
3、 按下表步驟加樣：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
樣本 | 100 | 100 | ||
蒸餾水 | 100 | |||
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | 100 | |||
工作液 | 900 | 900 | 900 | |
試劑一 | 900 | |||
37℃條件下反應(yīng)10 min | ||||
顯色液 | 50 | 50 | 50 | 50 |
37℃條件下避光反應(yīng)20 min | ||||
于450 nm處測定吸光度。分別記為A測定、A對照、A空白、A標(biāo)準(zhǔn)。ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白?？瞻坠苤恍枳?/span>1-2次；標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次。 | ||||
三、β-HB含量計算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）。
2、 計算公式
（1）按照蛋白濃度計算
β-HB含量（μmol /mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷126.09×1000=7.931x÷Cpr
（2）按照血清（漿）體積計算
β-HB含量（μmol /mL）=x×V樣÷V樣÷126.09×1000=7.931x
V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，100 μL=0.1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；126.09：β-羥基丁酸鈉分子量，mg/mmol；1000：1mmol=1000μmol。
注意事項：
1、顯色完成后，請在10 min之內(nèi)完成檢測。
2、如果ΔA測定低于或超過標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值范圍，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例：
1. 取100μL 牛血清按上述步驟進行實驗，用1mL玻璃比色皿測定后進行計算ΔA測定=A測定-A對照=0.585- 0.057= 0.528，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7905x+0.0221，的x=0.640。計算
β-HB含量（μmol /mL）=7.931x=5.076 μmol /mL
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