Na⁺K⁺-ATP酶活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC0060
規(guī)格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：用時取1支加1 mL蒸餾水，現用現配。用不完的試劑-20℃分裝保存一周。

2. 試劑六：用時加入15 mL蒸餾水，溶解后2-8℃保存兩周。

3. 試劑七：用時加入15 mL蒸餾水，溶解后2-8℃保存兩周。

4. 標準品：10 μmol/mL標準磷貯備液。將標準品20倍稀釋，即取0.1 mL標準品加1.9 mL蒸餾水充分混勻，配成0.5 μmol/mL標準磷應用液。

5. 定磷劑的配制：按H₂O：試劑六：試劑七：試劑八=2:1:1:1（體積比）的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若變色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑根據實驗用量現用現配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
產品說明：
Na⁺K⁺- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。
Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。
ATP                  ADP + Pi        


注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：

• 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細菌、細胞或組織樣本的制備：
   細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率200w，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
   組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟
1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至660nm，蒸餾水調零。
2、酶促反應（在EP管中加入下列試劑）

3、定磷(在1.5mL EP管中依次加入下列試劑)

三、Na⁺K⁺-ATP酶活計算
1、血清（漿）Na⁺K⁺-ATPase活力的計算：
定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP產生1μmoL無機磷的量為一個酶活力單位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= C標×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V總÷V樣÷T
=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）
2、組織、細菌或細胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的計算：
（1）按蛋白濃度計算：
定義：規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP產生1μmoL無機磷的量為一個酶活力單位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mg prot）= C標×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V總÷（Cpr×V樣）÷T
=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷Cpr
（2）按樣本質量計算：
定義：規(guī)定每小時每克組織中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP產生1μmoL無機磷的量為一個酶活力單位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/g 質量）= C標×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W
（3）按細菌或細胞數量計算：
定義：規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP產生1μmoL無機磷的量為一個酶活力單位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/10⁴ cell）= C標×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T
=0.015×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）
C標：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.2mL；V樣總：加入試劑一體積，1mL；T：反應時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。
注意事項：
1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管保證測 24份Na⁺K⁺-ATP酶。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。
實驗實例：

1. 取0.1g小鼠心臟加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算A測定=1.216，A對照=0.842，A標準=0.398，A空白管=0.004，按樣本質量計算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g 質量)=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W=71.19 U/g 質量。

1. 取0.1g稗草加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算A測定=0.474，A對照=0.403，A標準=0.398，A空白=0.004，按樣本質量計算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g 質量)=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W=13.52 U/g 質量。

1. 取200μL小鼠血漿稀釋2倍，直接檢測，A測定管=0.958，A對照=0.906，A標準=0.398，A空白=0.004，按液體體積計算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）=7.5×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×2（稀釋倍數）=1.98 U/mL。
相關發(fā)表文獻：

1. Fangzhou Chen,Ying Zhao,Huizhao Chen,et aL. MicroRNA-98 reduces amyLoid β-protein production and improves oxidative stress and mitochondriaL dysfunction through the Notch signaLing pathway via HEY2 in ALzheimer's disease mice. InternationaL JournaL of MoLecuLar Medicine. October 2018;(IF2.928)

2. Wanxiu Cao,Jing Li,Yaoxian Chin,et aL. Transcriptomic anaLysis reveaLs effects of fucoxanthin on intestinaL

gLucose transport. JournaL of FunctionaL Foods. October 2018;(IF3.197)

1. Li M, Jiang C, Zhang Y, et al. Activities of Amphioxus GH-like protein in osmoregulation: insight into origin of vertebrate GH family[J]. International journal of endocrinology, 2017, 2017.

參考文獻：
[1] Luo L G, MacLean D B. Effects of thyroid hormone on food intake, hypothalamic Na/K ATPase activity and ATP content[J]. Brain research, 2003, 973(2): 233-239.
[2] Cornelius F. Modulation of Na, K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steady-state kinetics[J]. Biochemistry, 2001, 40(30): 8842-8851.
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